Pseudotime All Cells

Gametocyte Development in Plasmodium berghei

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1. Introduction and Aims

We have merged the two datasets together in GCSKO_merge.Rmd. Here, we will perform pseudotime analysis on the dataset and build modules of genes that show similar expression across this pseudotime.

2. Read in the data

Load/Install the Required Packages

[1] "patchwork is loaded correctly"
[1] "viridis is loaded correctly"
[1] "Seurat is loaded correctly"
[1] "cowplot is loaded correctly"
[1] "gridExtra is loaded correctly"
[1] "grid is loaded correctly"
[1] "Hmisc is loaded correctly"
[1] "reshape2 is loaded correctly"
[1] "dplyr is loaded correctly"

Loading required package: monocle3

Attaching package: ‘monocle3’

The following objects are masked from ‘package:Biobase’:

    exprs, fData, fData<-, pData, pData<-

[1] "monocle3 is loaded correctly"

load data

tenx.mutant.integrated is needed from the merge script

## load dataset
tenx.mutant.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")

3. Pseudotime Analysis Using Monocle

For monocle input, we can use all WT cells, provided we correct for batch effects.

https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/differential/

We have 5 potential sources of WT information:

1. 10X - 5k run

2. SS2 - WT cells in this experiment

3. SS2 - 10X (published)

4. 10X - MCA (published)

5. 10X - 30k run

When you try and use 1 and 2 together, there are issues with calling modules. I think this is to do with the integration that Seurat does, so since the 10X data is complete (i.e. covers the lifecycle), we will sacrifice some extra power (a few more cells) so that we can call more modules.

B. 10X cells

The above analysis results in hardly any genes in the modules, most likely due to the normalisation effect of Seurat. Here, we will take just the 10X object, which has coverage of the lifecyle and also does not require batch correction.

Pseudotime calculation

Preprocess

## extract data
## this extracts wt only cells
#wt_cells <- rownames(tenx.mutant.integrated@meta.data[which(tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_combined == "WT" | tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_combined == "WT_10X"),])

## extracts only 10x cells 
wt_cells <- rownames(tenx.mutant.integrated@meta.data[which(tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_combined == "WT_10X"),])

## make a new Seurat of this
seurat.object <-subset(tenx.mutant.integrated, cells = wt_cells)

## check that this is the same as the pb_sex_filtered object
#data_test <- as(as.matrix(GetAssayData(pb_sex_filtered, assay = "RNA", slot = "data")), 'sparseMatrix')
#is.equal
#is.identical

## extract counts and pheno:
## the reason we use the integrated and then subsetted is because these cells have been normalised whereas the cells in pb_sex_filtered have not been normalised (well they have but with doublets in them)
data <- as(as.matrix(GetAssayData(seurat.object, assay = "RNA", slot = "data")), 'sparseMatrix')
## make phenodata
pd <- data.frame(seurat.object@meta.data)
## keep only the columns that are relevant in metadata
#pData <- pd %>% select(orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA)
## make gene metadata
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))

## Construct monocle cds
monocle.object <- new_cell_data_set(expression_data = data, cell_metadata = pd, gene_metadata = fData)

## preprocess
monocle.object = preprocess_cds(monocle.object, num_dim = 50, norm_method = "none")
### if using integrated data:
# norm_method = "none", alignment_group = "~ experiment"

## plot jack straw plot
#plot_pc_variance_explained(monocle.object)

#monocle.object = reduce_dimension(monocle.object, reduction_method = "UMAP", preprocess_method = "PCA", umap.metric = "euclidean", umap.n_neighbors = 50, umap.min_dist = 0.5, verbose = FALSE)

#plot_cells(monocle.object, color_cells_by="experiment")

Graph Learning

## add UMAP from Seurat
monocle.object@int_colData@listData$reducedDims@listData[["UMAP"]] <- seurat.object@reductions[["DIM_UMAP"]]@cell.embeddings

## cluster
## this is essential to run the learn_graph function later on
monocle.object = cluster_cells(monocle.object)

## plot initial clustering by monocle
#plot_cells(monocle.object, color_cells_by="cluster", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1)

## map pseudotime
monocle.object = learn_graph(monocle.object, learn_graph_control=list(ncenter=300), use_partition = FALSE)

  |                                                                     
  |                                                               |   0%
  |                                                                     
  |===============================================================| 100%

# learn_graph_control=list(ncenter=500) - play with this parameter

## Plot cells
plot_cells(monocle.object, color_cells_by="partition", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1) 

`select_()` is deprecated as of dplyr 0.7.0.
Please use `select()` instead.
This warning is displayed once every 8 hours.
Call `lifecycle::last_warnings()` to see where this warning was generated.The `add` argument of `group_by()` is deprecated as of dplyr 1.0.0.
Please use the `.add` argument instead.
This warning is displayed once every 8 hours.
Call `lifecycle::last_warnings()` to see where this warning was generated.

Pseudotime Calculation

## a helper function to identify the root principal points:
get_earliest_principal_node <- function(cds, time_bin="4"){
  cell_ids <- which(colData(cds)[, "seurat_clusters"] == time_bin)
  closest_vertex <-
  cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex
  closest_vertex <- as.matrix(closest_vertex[colnames(cds), ])
  root_pr_nodes <-
  igraph::V(principal_graph(cds)[["UMAP"]])$name[as.numeric(names
  (which.max(table(closest_vertex[cell_ids,]))))]
  
  root_pr_nodes
}

## Order the cells and caclulate pseudotime
#monocle.object = order_cells(monocle.object, root_pr_nodes=get_earliest_principal_node(monocle.object))
monocle.object = order_cells(monocle.object)

Listening on http://127.0.0.1:6107

## Plot
plot_cells(monocle.object, color_cells_by = "pseudotime", label_cell_groups=FALSE, cell_size = 2, x = 2, y = 1) +
  coord_fixed() +
  theme_void() +
  labs(title = "Pseudotime") +
  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))

Module Construction

## find genes that change as a function of pt:
monocle.object_pr_test_res <- graph_test(monocle.object, neighbor_graph="principal_graph", cores=8)

Registered S3 method overwritten by 'spdep':
  method   from
  plot.mst ape 

  |                                                       |   0%, ETA NA
  |                                                 |   0%, ETA 01:29:02
  |                                                    |   0%, ETA 47:59
  |                                                    |   0%, ETA 32:16
  |                                                    |   0%, ETA 25:01
  |                                                    |   0%, ETA 20:30
  |                                                    |   0%, ETA 17:29
  |                                                    |   0%, ETA 15:07
  |                                                    |   0%, ETA 11:53
  |                                                    |   0%, ETA 10:54
  |                                                    |   0%, ETA 09:55
  |                                                    |   0%, ETA 09:25
  |                                                    |   0%, ETA 08:45
  |                                                    |   0%, ETA 08:09
  |                                                    |   0%, ETA 07:17
  |                                                    |   0%, ETA 06:58
  |                                                    |   0%, ETA 06:43
  |                                                    |   0%, ETA 06:27
  |                                                    |   0%, ETA 06:09
  |                                                    |   0%, ETA 05:53
  |                                                    |   0%, ETA 05:27
  |                                                    |   0%, ETA 05:15
  |                                                    |   1%, ETA 05:01
  |                                                    |   1%, ETA 04:53
  |                                                    |   1%, ETA 04:45
  |                                                    |   1%, ETA 04:27
  |                                                    |   1%, ETA 04:13
  |                                                    |   1%, ETA 04:08
  |                                                    |   1%, ETA 04:04
  |                                                    |   1%, ETA 04:01
  |                                                    |   1%, ETA 03:56
  |                                                    |   1%, ETA 03:50
  |                                                    |   1%, ETA 03:45
  |                                                    |   1%, ETA 03:41
  |                                                    |   1%, ETA 03:36
  |                                                    |   1%, ETA 03:37
  |                                                    |   1%, ETA 03:33
  |                                                    |   1%, ETA 03:29
  |                                                    |   1%, ETA 03:25
  |                                                    |   1%, ETA 03:21
  |                                                    |   1%, ETA 03:17
  |                                                    |   1%, ETA 03:13
  |                                                    |   1%, ETA 03:10
  |                                                    |   1%, ETA 03:12
  |=                                                   |   1%, ETA 03:09
  |=                                                   |   1%, ETA 03:06
  |=                                                   |   1%, ETA 03:03
  |=                                                   |   1%, ETA 02:57
  |=                                                   |   1%, ETA 02:54
  |=                                                   |   1%, ETA 02:53
  |=                                                   |   1%, ETA 02:54
  |=                                                   |   1%, ETA 02:51
  |=                                                   |   1%, ETA 02:49
  |=                                                   |   1%, ETA 02:46
  |=                                                   |   1%, ETA 02:44
  |=                                                   |   1%, ETA 02:42
  |=                                                   |   1%, ETA 02:40
  |=                                                   |   1%, ETA 02:39
  |=                                                   |   1%, ETA 02:41
  |=                                                   |   1%, ETA 02:39
  |=                                                   |   1%, ETA 02:37
  |=                                                   |   1%, ETA 02:35
  |=                                                   |   1%, ETA 02:33
  |=                                                   |   1%, ETA 02:31
  |=                                                   |   1%, ETA 02:29
  |=                                                   |   1%, ETA 02:28
  |=                                                   |   1%, ETA 02:29
  |=                                                   |   1%, ETA 02:28
  |=                                                   |   1%, ETA 02:26
  |=                                                   |   1%, ETA 02:24
  |=                                                   |   2%, ETA 02:21
  |=                                                   |   2%, ETA 02:20
  |=                                                   |   2%, ETA 02:19
  |=                                                   |   2%, ETA 02:19
  |=                                                   |   2%, ETA 02:18
  |=                                                   |   2%, ETA 02:17
  |=                                                   |   2%, ETA 02:16
  |=                                                   |   2%, ETA 02:14
  |=                                                   |   2%, ETA 02:11
  |=                                                   |   2%, ETA 02:10
  |=                                                   |   2%, ETA 02:11
  |=                                                   |   2%, ETA 02:10
  |=                                                   |   2%, ETA 02:09
  |=                                                   |   2%, ETA 02:08
  |=                                                   |   2%, ETA 02:07
  |=                                                   |   2%, ETA 02:07
  |=                                                   |   2%, ETA 02:05
  |=                                                   |   2%, ETA 02:04
  |=                                                   |   2%, ETA 02:05
  |=                                                   |   2%, ETA 02:04
  |=                                                   |   2%, ETA 02:04
  |=                                                   |   2%, ETA 02:03
  |=                                                   |   2%, ETA 02:02
  |=                                                   |   2%, ETA 02:01
  |=                                                   |   2%, ETA 02:00
  |=                                                   |   2%, ETA 02:00
  |=                                                   |   2%, ETA 01:59
  |=                                                   |   2%, ETA 02:00
  |=                                                   |   2%, ETA 02:00
  |=                                                   |   2%, ETA 01:59
  |=                                                   |   2%, ETA 01:58
  |=                                                   |   2%, ETA 01:57
  |=                                                   |   2%, ETA 01:56
  |=                                                   |   2%, ETA 01:56
  |=                                                   |   2%, ETA 01:56
  |=                                                   |   2%, ETA 01:56
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  |=                                                   |   2%, ETA 01:53
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  |=                                                   |   2%, ETA 01:50
  |=                                                   |   2%, ETA 01:50
  |=                                                   |   2%, ETA 01:50
  |=                                                   |   3%, ETA 01:50
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  |=                                                   |   3%, ETA 01:50
  |=                                                   |   3%, ETA 01:49
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  |=                                                   |   3%, ETA 01:48
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  |=                                                   |   3%, ETA 01:47
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  |=                                                   |   3%, ETA 01:46
  |=                                                   |   3%, ETA 01:46
  |=                                                   |   3%, ETA 01:46
  |=                                                   |   3%, ETA 01:46
  |=                                                   |   3%, ETA 01:45
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  |=                                                   |   3%, ETA 01:44
  |=                                                   |   3%, ETA 01:44
  |=                                                   |   3%, ETA 01:44
  |==                                                  |   3%, ETA 01:44
  |==                                                  |   3%, ETA 01:43
  |==                                                  |   3%, ETA 01:43
  |==                                                  |   3%, ETA 01:43
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  |==                                                  |   3%, ETA 01:42
  |==                                                  |   3%, ETA 01:41
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  |==                                                  |   4%, ETA 01:30
  |==                                                  |   4%, ETA 01:29
  |==                                                  |   4%, ETA 01:29
  |==                                                  |   4%, ETA 01:30
  |==                                                  |   5%, ETA 01:29
  |==                                                  |   5%, ETA 01:29
  |==                                                  |   5%, ETA 01:29
  |==                                                  |   5%, ETA 01:29
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |==                                                  |   5%, ETA 01:29
  |==                                                  |   5%, ETA 01:29
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |==                                                  |   5%, ETA 01:28
  |===                                                 |   5%, ETA 01:28
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:28
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:28
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:27
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:26
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   5%, ETA 01:25
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:25
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:24
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:23
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:22
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   6%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:20
  |===                                                 |   7%, ETA 01:20
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:21
  |===                                                 |   7%, ETA 01:20
  |===                                                 |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:21
  |====                                                |   7%, ETA 01:21
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
  |====                                                |   7%, ETA 01:20
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  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   7%, ETA 01:19
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   7%, ETA 01:18
  |====                                                |   8%, ETA 01:18
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  |====                                                |   8%, ETA 01:18
  |====                                                |   8%, ETA 01:18
  |====                                                |   8%, ETA 01:18
  |====                                                |   8%, ETA 01:17
  |====                                                |   8%, ETA 01:17
  |====                                                |   8%, ETA 01:17
  |====                                                |   8%, ETA 01:17
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  |====                                                |   8%, ETA 01:17
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  |====                                                |   8%, ETA 01:16
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  |====                                                |   8%, ETA 01:16
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  |====                                                |   8%, ETA 01:16
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  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:13
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:12
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  10%, ETA 01:11
  |=====                                               |  11%, ETA 01:11
  |=====                                               |  11%, ETA 01:11
  |=====                                               |  11%, ETA 01:11
  |=====                                               |  11%, ETA 01:11
  |======                                              |  11%, ETA 01:11
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:11
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:10
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  11%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:09
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:08
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |======                                              |  12%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:07
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:06
  |=======                                             |  13%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:05
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |=======                                             |  14%, ETA 01:04
  |========                                            |  14%, ETA 01:04
  |========                                            |  14%, ETA 01:04
  |========                                            |  14%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
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  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:03
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
  |========                                            |  15%, ETA 01:04
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  |========                                            |  15%, ETA 01:12
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  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
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  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
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  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:11
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:12
  |========                                            |  15%, ETA 01:11
  |========                                            |  15%, ETA 01:11
  |========                                            |  15%, ETA 01:11
  |========                                            |  15%, ETA 01:11
  |========                                            |  15%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:11
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:10
  |========                                            |  16%, ETA 01:09
  |========                                            |  16%, ETA 01:09
  |========                                            |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  16%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:09
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  17%, ETA 01:08
  |=========                                           |  18%, ETA 01:08
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
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  |=========                                           |  18%, ETA 01:07
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  |==========                                          |  19%, ETA 01:06
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  |==========                                          |  19%, ETA 01:06
  |==========                                          |  19%, ETA 01:06
  |==========                                          |  19%, ETA 01:06
  |==========                                          |  19%, ETA 01:06
  |==========                                          |  19%, ETA 01:06
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  |==========                                          |  19%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  19%, ETA 01:05
  |==========                                          |  19%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
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  |==========                                          |  20%, ETA 01:05
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  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
  |===========                                         |  20%, ETA 01:05
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  |===========                                         |  20%, ETA 01:04
  |===========                                         |  20%, ETA 01:04
  |===========                                         |  20%, ETA 01:04
  |===========                                         |  20%, ETA 01:04
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  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
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  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
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  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
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  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  21%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:04
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |===========                                         |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  22%, ETA 01:03
  |============                                        |  23%, ETA 01:03
  |============                                        |  23%, ETA 01:03
  |============                                        |  23%, ETA 01:03
  |============                                        |  23%, ETA 01:03
  |============                                        |  23%, ETA 01:03
  |============                                        |  23%, ETA 01:08
  |=============                                       |  24%, ETA 01:02
  |=============                                       |  24%, ETA 01:02
  |=============                                       |  24%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:02
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
  |=============                                       |  25%, ETA 01:01
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  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:59
  |===============                                     |  29%, ETA 00:58
  |===============                                     |  29%, ETA 00:58
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  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:57
  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:58
  |================                                    |  30%, ETA 00:57
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  |================                                    |  30%, ETA 00:57
  |================                                    |  30%, ETA 00:57
  |================                                    |  30%, ETA 00:57
  |================                                    |  30%, ETA 00:57
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  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:57
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  |================                                    |  31%, ETA 00:57
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  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:57
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  |================                                    |  31%, ETA 00:57
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  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:57
  |================                                    |  31%, ETA 00:56
  |================                                    |  31%, ETA 00:56
  |================                                    |  31%, ETA 00:56
  |================                                    |  31%, ETA 00:56
  |================                                    |  31%, ETA 00:56
  |================                                    |  32%, ETA 00:56
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  |==================                                  |  35%, ETA 00:54
  |==================                                  |  35%, ETA 00:54
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:54
  |==================                                  |  35%, ETA 00:54
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
  |==================                                  |  35%, ETA 00:53
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  |==================                                  |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:53
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  36%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
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  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
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  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
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  |===================                                 |  37%, ETA 00:52
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  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:52
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
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  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
  |====================                                |  38%, ETA 00:51
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  |====================                                |  39%, ETA 00:51
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  |====================================================| 100%, ETA 00:00
  |====================================================| 100%, ETA 00:00
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  |====================================================| 100%, ETA 00:00
  |====================================================| 100%, ETA 00:00
  |================================================| 100%, Elapsed 01:26

## find significant genes
pr_deg_ids <- row.names(subset(monocle.object_pr_test_res, q_value < 0.05))

## collect into modules
gene_module_df <- find_gene_modules(monocle.object[pr_deg_ids,], resolution=c(10^seq(-6,2)))

Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’

## how many genes in modules?
dim(gene_module_df)

[1] 4572    5

[1] "there are  25 modules"

Module Information

Which module do the mutant genes belong to?

## create a list of our mutant gene IDs
list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1144800", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")

## make a dataframe to convert the gene IDs into actual IDs
df_mutant_ids <- as.data.frame(unique(cbind(tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_gene_updated, tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_updated)))[-c(1, 3),]
# remove the "820" bit on 10
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_820", "", df_mutant_ids$V1)
# change the underscore (_) to a dash (-) in gene IDs
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_", "-", df_mutant_ids$V1)
names(df_mutant_ids) <- c("gene_ID", "mutant_identity")

## subset modules df to include only mutant gene IDs
df_mutant_gene_modules <- as.data.frame(gene_module_df[which(gene_module_df$id %in% list_of_mutant_genes),])
names(df_mutant_gene_modules)[1] <- "gene_ID"

## merge dataframes
df_mutant_gene_modules <- merge(df_mutant_gene_modules, df_mutant_ids, by = "gene_ID")

## Inspect
df_mutant_gene_modules

All female genes (3, 21, 13, 17, 20, 28) are in the same module except for 28 which seems to have the opposite phenotype for its expression (i.e. more highly expressed in males).

Of all male genes (oom, 29, 2, 19, 10), there is much more variation in module assignment - oom and 29 have severe phenotyping effects. 2 and 19 are in the same module but 10 is on it’s own.

The modules of interest are therefore:

table(df_mutant_gene_modules$module)

 1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 
 0  0  0  3  0  0  0  1  5  0  0  0  0  0  0  0  0  1  1  0  0  0  0  0 
25 
 0 

Which modules do other genes of interest lie in?:

## landmark genes (genes of interest)
# AP2G - PBANKA-1437500
# AP2 - PBANKA-0909600 - from poran paper
# AP2G-2 - PBANKA-1034300 
# PBANKA-1319500 - CCP2 - female 820
# PBANKA-0416100 - MG1 - male 820
# PBANKA-0831000 - MSP1 - late asexual
# PBANKA-1102200 - MSP8 - early asexual (from Bozdech paper)

## create a list of landmark genes
list_of_landmark_genes <- c("PBANKA-1437500", "PBANKA-0909600","PBANKA-1034300", "PBANKA-1319500", "PBANKA-0416100", "PBANKA-0831000", "PBANKA-1102200")

## make dataframe
df_landmark_gene_modules <- gene_module_df[which(gene_module_df$id %in% list_of_landmark_genes),]

## inspect
df_landmark_gene_modules

oom is in the same cluster as AP2G

The late female and male 820 markers are not in the same cluster as our mutants which is reassuring since we know they have an effect before the makrer is switched on.

Plotting

plot out modules

plot_cells(monocle.object, genes=gene_module_df %>% filter(module %in% c(1:20)),
           cell_size = 2, 
           x = 2, y = 1,
           label_cell_groups=FALSE,
           scale_to_range = TRUE,
                          show_trajectory_graph=FALSE,
                          group_label_size = 15) +
                          scale_colour_viridis_c(name = "expression", option = "C", alpha = 1) +
                          coord_fixed() +
                          theme_void() +
                          theme(legend.position = "bottom")

Scale for 'colour' is already present. Adding another scale for
'colour', which will replace the existing scale.

Make a dataframe to plot

## make cell group df
cell_group_df <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object)), cell_group=colData(monocle.object)$seurat_clusters)

## make plotting df
agg_mat <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df, cell_group_df)

Find out how many genes there are per total so we can add this to the plot

## how many genes per module?
genes_per_module <- as.data.frame(table(gene_module_df$module))
genes_per_module

by cluster plot

Make annotations to add to the heatmap

## change names for row names to include "module " at the beginning of them
row.names(agg_mat) <- stringr::str_c("Module ", row.names(agg_mat))

## add number of cells to the rownames for the module
for(i in seq_along(genes_per_module$Freq)){
  row.names(agg_mat)[i] <- stringr::str_c(row.names(agg_mat)[i]," (n = " ,genes_per_module$Freq[i], ")")
}

## create annotation of clusters for heatmap
cluster_anno <- data.frame(cluster = unique(colData(monocle.object)$seurat_clusters))
row.names(cluster_anno) <- cluster_anno$cluster

## clusters were defined in the merge script earlier as:
male_clusters <- c("26", "22", "11", "17")
female_clusters <- c("30", "32", "27", "12", "13", "18")
asex_clusters <- c("7", "10", "9", "14", "1", "3", "4", "8", "5", "6", "2", "0", "16", "19", "28", "15", "21", "23", "24", "25", "31", "29", "33")
bipotential_clusters <- c("20")

## add identities to the column
cluster_anno$group <- NA
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% asex_clusters)] <- "Asexual"
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% male_clusters)] <- "Male"
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% female_clusters)] <- "Female"
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% bipotential_clusters)] <- "Committed"
cluster_anno <- cluster_anno[ , 2, drop = FALSE]
cluster_anno

## Make a df of meta data
## this is used later in the ridgeplots too
## extract pseudotime values
pt_values <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object, reduction_method = "UMAP"))
pt_values$cell_name <- rownames(pt_values)
meta_data_df <- as.data.frame(monocle.object@colData)
meta_data_df$cell_name <- rownames(meta_data_df)
meta_data_df <- merge(meta_data_df, pt_values, by = "cell_name")
## the pt will be added to the last column so add the name pt to the merged df
names(meta_data_df)[length(names(meta_data_df))] <- "pt"

## add median pseudotime per cluster
## help was obtained here:https://stackoverflow.com/questions/54360855/calculate-mean-for-column-grouped-by-values-of-two-other-columns
## make subsetted dataframe with just cluster and pt
df_median_pt <- meta_data_df[ ,c("pt", "seurat_clusters")]
## apply across dataframe to get median
mean.df1 <- tapply(df_median_pt$pt, list(df_median_pt$seurat_clusters), median)
mean.df2 <- as.data.frame(as.table(mean.df1))
## rename cols
names(mean.df2) <- c("seurat_clusters", "pt_Median")
## rename rows
rownames(mean.df2) <- mean.df2$seurat_clusters
## to make each value have the mean in the original dataframe
#merge(df_median_pt, mean.df2)
## add to annotation dataframe
cluster_anno <- merge(cluster_anno, mean.df2, by=0)

## add rownames to dataframe
rownames(cluster_anno) <- cluster_anno$Row.names
## subset to have only info of interest
cluster_anno <- cluster_anno[,c(2,4)]
names(cluster_anno) <- c("Identity", "Median_Pseudotime_of_Cluster")

Plot

## make annotation colours
annotation_colours <- list(Identity = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Asexual= "#0052c5", Committed = "#f2eb23"),
                           Median_Pseudotime_of_Cluster = magma(12, direction = 1))

## reorder the levels
## make df of data
agg_mat_df <- as.data.frame(agg_mat)
## remove levels in my_levels that are not present here - i.e. clusters that are missing because they are not represented in the 10X data
## my_levels was defined in the merge script as the order we want to plot clusters in:
my_levels <- c(asex_clusters, bipotential_clusters, male_clusters, female_clusters)
## reorder the levels so you can plot the cluters as you wish
my_levels_10x_data <- my_levels[which(my_levels %in% colnames(agg_mat_df))]
## order the annotation
cluster_anno <- cluster_anno[(match(my_levels_10x_data, rownames(cluster_anno))), ]
## sort the values in the df
agg_mat_df <- agg_mat_df[ ,(match(my_levels_10x_data, colnames(agg_mat_df)))]

## plot heatmap
pheatmap::pheatmap(agg_mat_df, 
                   scale="column",
                   cluster_cols = FALSE,
                   clustering_method="ward.D2", 
                   annotation_col = cluster_anno, 
                   annotation_colors = annotation_colours,
                   #gaps_col = c(28,29,37),
                   cutree_rows = 12) + 
  theme(legend.position = "bottom")

## subset aggregated matrix to take out problematic clusters 22, 42, (44 - alreayd removed as it doesn't have any 10x cells)
agg_mat_df_scaled_subset <- agg_mat_df_scaled[, -which(colnames(agg_mat_df_scaled) %in% c(22,42))]

## make df of data
agg_mat_df_scaled_subset_df <- as.data.frame(agg_mat_df_scaled_subset)
## remove levels in my_levels that are not present here - i.e. clusters that are missing because they are not represented in the 10X data
my_levels_10x_data_subset <- my_levels[which(my_levels %in% colnames(agg_mat_df_scaled_subset_df))]
## sort the values
agg_mat_df_scaled_subset <- agg_mat_df_scaled_subset[ ,(match(my_levels_10x_data_subset, colnames(agg_mat_df_scaled_subset)))]


## subset anno
cluster_anno_subset <- cluster_anno[-which(rownames(cluster_anno) %in% c(22,42)),] 

## subset the annotation
## add annotation:
heatmap_annotation_subset <- HeatmapAnnotation(df = cluster_anno_subset,
                                        col = list(
Identity = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Asexual= "#0052c5", Committed = "#f2eb23")),
                                        annotation_legend_param = list(Median_Pseudotime_of_Cluster = list(direction = "horizontal"), Identity = list(nrow = 1)))


library(ComplexHeatmap)
library(RColorBrewer)
modules_heatmap <- Heatmap(agg_mat_df_scaled_subset,
        column_order = NULL,
        clustering_method_rows = "ward.D2",
        bottom_annotation = heatmap_annotation_subset,
        col = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n = 7, name =
  "RdYlBu")))(100), 
        heatmap_legend_param = list(direction = "horizontal"))
draw(modules_heatmap, merge_legend = TRUE, heatmap_legend_side = "bottom", 
    annotation_legend_side = "bottom")

## save the gene modules in case you want to return to these later
modules_df_original_10x_data_set <- gene_module_df

It would be nice to include a measure of Psuedotime in the heatmap. We will first test the variance of Pseudotime in each cluster

## redefine order of clusters:
meta_data_df$seurat_clusters <- factor(x = meta_data_df$seurat_clusters, levels = my_levels)

## plot
ggplot(meta_data_df, aes(x = pt, y = seurat_clusters, fill = stat(x))) +
  geom_density_ridges_gradient(scale = 3, rel_min_height = 0.01, jittered_points = TRUE, quantile_lines = TRUE, quantiles = 2, point_alpha = 0.5, alpha = 0.5) +
  scale_fill_viridis_c(name = "Pseudotime", option = "C") +
  labs(title = 'PT by Cluster') +
  theme_classic() +
  ## annotate males
  geom_hline(aes(yintercept = 37.5)) +
  ## annotate females
  geom_hline(aes(yintercept = 29.5)) +
  ## annotate hermaphrodite
  geom_hline(aes(yintercept = 28.5))

module expression in mutants

Make a heatmap of module expression in mutants:

## the aggregate_gene_expression function in Monocle is located here: https://github.com/cole-trapnell-lab/monocle3/blob/1a02274209c765fe7a60f533a31b1da3dacf6785/R/cluster_genes.R
## One can use the function as is if you make a monocle object of all cells and use the module df created above

## separate the mutants into each sex 

## define which clusters will be which identity
male_clusters <- c("45", "30", "42", "18", "25", "37", "32", "29")
female_clusters <- c("39", "40", "38", "10", "26", "19", "17", "36")
asex_clusters <- c("0", "22", "8", "1", "20", "2", "15", "6", "14", "12", "13", "23", "31", "21", "44", "33", "35", "28", "27", "34", "43", "41", "4", "16", "5", "11", "7", "11", "3", "9", "24")

## make a dataframe for just male cells:
male_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% male_clusters),]
female_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% female_clusters),]

## make cell group df
cell_group_df_genotype <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object)), cell_group=colData(monocle.object)$identity_combined)

## make plotting df
agg_mat_mutants <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df, cell_group_df_genotype)

## plot
pheatmap::pheatmap(agg_mat_mutants, scale="column", clustering_method="ward.D2")

Pseudotime of all cells

This will allow one to plot PT of all cells rather than just the 10x cells we did above

save

ggsave("../images_to_export/pt_all_UMAP_pt.png", plot = umap_pt, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 20, height = 20, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

Add original pt values

## extract pt values
pt_values <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object.all, reduction_method = "UMAP"))

tenx.mutant.integrated <- AddMetaData(tenx.mutant.integrated, pt_values, "old_pt_values")

Save old modules

write.csv(modules_df_original_10x_data_set, file = "../data_to_export/modules_df_original_10x_data_set.csv")

dot plot of expression by pt

annotations for plot

plot

## plot
dot_plot_paper_figure <- DotPlot(tenx.mutant.integrated, 
                                 features = (c("PBANKA-1144800", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-0902300", "PBANKA-1454800", "PBANKA-0828000", "PBANKA-0413400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-0102400", "PBANKA-1447900", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1437500", "PBANKA-0416100", "PBANKA-1300700", "PBANKA-0915000", "PBANKA-1443300", "PBANKA-1145900")), group.by = "seurat_clusters_plotting") +
  theme_classic() +
  ## change appearance and remove axis elements, and make room for arrows, and also change posoition of legends relative to one another
  theme(axis.text.x = element_text(size=20, angle = 45, hjust=1,vjust=1, family="Arial"), legend.position = "bottom", legend.direction = "horizontal", legend.box = "vertical", plot.margin = unit(c(1,3,1,3), "lines"), text=element_text(size=20, family="Arial"), axis.title=element_text(size=20,family="Arial")) +
  ##add these to above to remove y = plot.title = element_blank(), axis.text.y = element_blank(), axis.ticks.y = element_blank(), axis.title.y = element_blank()
  ## change the colours
  scale_colour_viridis(option = "inferno", guide = "colourbar", na.value="white", begin = 0, end = 1, direction = 1) +
  ## change x axis label
  labs(x = "Gene",  title = "", y = "Cluster") +
  ## annotate asex
  geom_hline(aes(yintercept = (length(asex_clusters)+0.5))) +
  ## annotate bipotential
  geom_hline(aes(yintercept = (length(c(asex_clusters, bipotential_clusters))+0.5))) +
  ## annotate sexes
  geom_hline(aes(yintercept = (length(c(asex_clusters, bipotential_clusters, male_clusters))+0.5))) +
  ## change label on bottom of plot so we can indicate markers
   scale_x_discrete(labels = ((c(expression(paste(italic("fd5"))),
    expression(paste(italic("fd4"))),
    expression(paste(italic("fd3"))),
    expression(paste(italic("fd2"))),
    expression(paste(italic("fd1"))),
    expression(paste(italic("gd1"))),
    expression(paste(italic("md5"))),
    expression(paste(italic("md4"))),
    expression(paste(italic("md3"))),
    expression(paste(italic("md2"))),
    expression(paste(italic("md1"))),
    expression(paste(italic("ap2-g"))),
    expression(paste(italic("dhc, putative"), "(male)")),
    expression(paste(italic("ccp1"), "(female)")),
    expression(paste(italic("ama1"), "(schizont)")),
    expression(paste(italic("msp9"), "(troph)")),
    expression(paste(italic("mahrp1b"), "(ring)"))))))  +
  ## add annotation on top of plot
  #geom_rect(aes(xmin = 0, xmax = 1), ymin = length(cluster_anno$Identity), ymax = length(cluster_anno$Identity) + 1) +
    ## flip coordinates 
    geom_rect(data = cluster_anno, mapping=aes(xmin=x1, xmax=x2, ymin=y1, ymax=y2, fill=Median_Pseudotime_of_Cluster), inherit.aes = FALSE) +
    scale_fill_viridis_c(option = "plasma") +
  ## flip coordinates 
  ## geoms below will use another color scale
    new_scale_fill() +
    geom_rect(data = cluster_anno, mapping=aes(xmin=Bx1, xmax=Bx2, ymin=By1, ymax=By2, fill=Identity), inherit.aes = FALSE) +
    scale_fill_manual(values = c("Male" ="#016c00", "Female"="#a52b1e", "Asexual"= "#0052c5", "Committed" = "#f2eb23")) +
    coord_flip()

Scale for 'colour' is already present. Adding another scale for
'colour', which will replace the existing scale.

  
  
## view
print(dot_plot_paper_figure)

save

ggsave("../images_to_export/pt_all_dot_plot.png", plot = dot_plot_paper_figure, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 30, height = 35, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

9. Save and Export

Save environment

## This saves everything in the global environment for easy recall later
#save.image(file = "GCSKO_pseudotime_allcells.RData")
#load(file = "GCSKO_pseudotime_allcells.RData")

Save object(s)

## save integrated object to file
saveRDS(tenx.mutant.integrated, file = "../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS") 
## restore the object
#tenx.mutant.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")

Appendix

Session Info

Acknowledgements

## help was obtained from here to understand how to use integrated counts from Seurat (the short awnser is that we used non-integrated counts and only 10x for this part). It also contains some useful code that was used for extracting UMAP coordaintes.
## https://github.com/satijalab/seurat/issues/1658

After PT of all cells:

Per branch analysis

## access the closest principal graph node vertex for each cell and assign it as a column in your colData table using:
colData(monocle.object.all)$closest_vertex <- monocle.object.all@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex[,1]

plot_cells(monocle.object.all, color_cells_by = "closest_vertex", label_cell_groups = FALSE)

## then subset the usual way:
#monocle.object_male <- monocle.object[,colData(monocle.object)$closest_vertex %in% c(1, 2, 3)]

Density Plots

## load package to plot ridge plots
library(ggridges)

## extract pseudotime values:
pt_values <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object.all, reduction_method = "UMAP"))
pt_values$cell_name <- rownames(pt_values)
meta_data_df <- as.data.frame(monocle.object.all@colData)
meta_data_df$cell_name <- rownames(meta_data_df)
meta_data_df <- merge(meta_data_df, pt_values, by = "cell_name")
names(meta_data_df)[128] <- "pt"

## define which clusters will be which identity
male_clusters <- c("45", "30", "42", "18", "25", "37", "32", "29")
female_clusters <- c("39", "40", "38", "10", "26", "19", "17", "36")
asex_clusters <- c("0", "22", "8", "1", "20", "2", "15", "6", "14", "12", "13", "23", "31", "21", "44", "33", "35", "28", "27", "34", "43", "41", "4", "16", "5", "11", "7", "11", "3", "9", "24")

## make a dataframe for just male cells:
male_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% male_clusters),]
female_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% female_clusters),]

ggplot(male_cells_df, aes(x = pt, y = reorder(identity_combined, pt, median), fill = stat(x))) +
  geom_density_ridges_gradient(scale = 3, rel_min_height = 0.01, jittered_points = TRUE, quantile_lines = TRUE, quantiles = 2, point_alpha = 0.5, alpha = 0.5) +
  scale_fill_viridis_c(name = "Pseudotime", option = "C") +
  labs(title = 'Male PT by genotype') +
  theme_classic()

ggplot(female_cells_df, aes(x = pt, y = reorder(identity_combined, pt, median), fill = stat(x))) +
  geom_density_ridges_gradient(scale = 3, rel_min_height = 0.01, jittered_points = TRUE, quantile_lines = TRUE, quantiles = 2) +
  scale_fill_viridis_c(name = "Pseudotime", option = "C") +
  labs(title = 'Female PT by genotype') +
  theme_classic()

ComplexHeatmap version

library(ComplexHeatmap)
library(RColorBrewer)

## pheatmap calculates Z scores for plotting values
scale_matrix_by_cols <- function (x) 
{
    m = apply(x, 1, mean, na.rm = T)
    s = apply(x, 1, sd, na.rm = T)
    return((x - m)/s)
}
## calculate z score by col
agg_mat_df_scaled <- t(as.matrix(scale_matrix_by_cols(t(agg_mat_df))))

## add annotation:
heatmap_annotation <- HeatmapAnnotation(df = cluster_anno,
                                        col = list(
Identity = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Asexual= "#0052c5", Committed = "#f2eb23")),
                                        annotation_legend_param = list(Median_Pseudotime_of_Cluster = list(direction = "horizontal"), Identity = list(nrow = 1)))

## plot
modules_heatmap <- Heatmap(agg_mat_df_scaled,
        column_order = NULL,
        clustering_method_rows = "ward.D2",
        bottom_annotation = heatmap_annotation,
        col = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n = 7, name =
  "RdYlBu")))(100), 
        heatmap_legend_param = list(direction = "horizontal"))
draw(modules_heatmap, merge_legend = TRUE, heatmap_legend_side = "bottom", 
    annotation_legend_side = "bottom")

## https://www.biostars.org/p/380544/